1.「イージーDNAピュア」について

「イージーDNAピュア」は、Whatman社®の特許であるFTA技術®をそのままに、実験動物向けの仕様・デザインを施した、核酸の抽出・精製・保存用カードです。

ごく少量の試料（マウスの尻尾からの血液など）を滴下するだけで、試料中の核酸がカード上に固定・安定化されます。カードの一部をパンチで抜き取り、精製試薬とバッファーによる簡単な洗浄工程を経て、有機溶媒などを使用することなく、短時間でPCR用テンプレートとしての使用が可能となります。

また、DNAを固定化したカードは、室温で長期（少なくとも10年）にわたり安定的に保存することができます。カード上のDNAはヌクレアーゼ、酸化、紫外線からも保護されます。また、カードに接触した有機体は破壊されるため、バクテリアやその他の微生物が成長することを防ぐほか、保存や輸送においては、ディープフリーザーや特殊な条件を必要としません。

「イージーDNAピュア」は、12連のサークルを持ち、雌雄の別、個体ID、動物種名、系統名、世代数などの情報を記載できるようにデザインしてあります。代表的な実験動物であるマウスやラット、ウサギなどにも使用しやすく、管理しやすい形状です。

2.操作方法

(1)準備するもの

	PCR用抽出精製	保存
イージーDNAピュア	○	○
FTA精製試薬（別売）	○
パンチャー（別売）*	○
TE -1バッファー**	○
カッティングマット（別売）	○
保護用ポーチ		○
乾燥剤		○

 * ：ハリスマイクロパンチまたはハリスユニコアパンチを別売。
実験動物用イヤーパンチャーも使用できます。

**：各ご施設で調製する必要があります。調製方法は4を参照。

(2)操作方法（マウステイルから採取する場合）

a.イージーDNAピュアへの血液試料アプライ

1. あらかじめ情報記入欄に個体情報を記しておきます。
2. マウスの尾を先端から約1.0cm切断します。
3. ただちに切断部から直接、カードサークルに血液を塗布・アプライします。切断片からの血液採取で、その場で作業ができない場合は、切断片を適当な容器に入れて氷冷保存したうえで２時間以内にカードにアプライしてください。
   サークルには20μL以上の血液をアプライしないでください。
4. 室温で最低でも1時間、自然乾燥させます。ドライヤーなどを用いる加熱乾燥は行わないでください。
5. カードを保存する場合は、低湿度に管理された乾冷所に保管するか、乾燥剤を入れた保護用ポーチに入れて保管してください。保護用ポーチで長期保存する場合は、6ヶ月ごとに乾燥剤を交換するようにしてください。

b.マウステイルから血液が採取できなかった場合

1. マウステイル溶解液（Digested Mouse Tail）を以下の手順で用意します。
2. 1.5mL容量のマイクロチューブに、新鮮な状態のマウステイル、または-20℃でエタノール保存されたテイルを入れます。エタノール保存した尾の場合、余分なエタノールを落として蒸発するまで空気乾燥させた後に、以下の手順に進んでください。
3. TNESバッファー（10mM Tris, pH 7.5, 400mM NaCl, 100mM EDTA, 0.6% SDS）600μＬと、プロテイナーゼK（10mg/mL）35μLをマイクロチューブに加えて、55℃で8〜24時間インキュベートします。
4. 組織片を避け、マウステイル溶解液5μＬをイージーDNAピュアのサークルに滴下します。滴下部を明確にしておくために、鉛筆またはボールペンで滴下箇所を囲んでください。
5. 室温で最低でも1時間、自然乾燥させます。ドライヤーなどを用いる加熱乾燥は行わないでください。
6. カードを保存する場合は、低湿度に管理された乾冷所に保管するか、乾燥剤を入れた保護用ポーチに入れて保管してください。保護用ポーチで長期保存する場合は、6ヶ月ごとに乾燥剤を交換するようにしてください。

c.PCR解析のためのサンプルディスク準備

1. 試料をアプライしたカードサークルが充分に乾燥していることを確認します。
2. イージーDNAピュアをカッティングマット上に置きます。別売のパンチャーで1.2〜1.5mmのディスクを打ち抜きます。
3. ディスクがパンチャーに入ったら、PCRチューブまたはトレー内に向けて射出プランジャーを押し下げて、ディスクを移し入れます。
   クロスコンタミネーションを防ぐために、パンチャーの先端部分はディスクを打ち抜くたびに、エタノール洗浄を行うか、イージーDNAピュアの未使用部分（小さなサークル）を1回打ち抜いてください。
4. FTA精製試薬200μLをPCRチューブに加え、軽く振とうした後、室温で5分間インキュベートします。
5. ピペッターでチューブ内の精製試薬を吸引除去します。
6. 上記4〜5の工程をさらに2回、計3回繰り返します。
7. TE ^-1バッファー（10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, pH8.0）200μLを加え、室温で5分間放置します。
8. ピペッターでチューブ内のバッファーを吸引除去します。
9. 上記7〜8の工程を繰り返し、計2回洗浄します。
10. PCRを行う前に、ディスクは室温で約1時間（または56℃で10分間）乾燥させます。

d.PCR解析

洗浄、乾燥させたサンプルディスクは、標準プロトコールに沿ってPCR解析に用いることができます。

ディスクはPCR反応過程に含まれ、ディスクを加えることにより反応ボリウムを変えたり、PCR条件を変更設定する必要はありません。

(3)PCR準備の標準的手順概要

3.マウス以外の動物に使用する場合

基本的には、「2.操作方法」で記した手順と同様です。

カードサークルへの血液試料のアプライ量が過剰にならないように注意してください。

4.TE ^-1バッファーの調製方法

1. まず、100×TE ^-1（1M Tris-HCl, 10mM EDTA, pH 8.0）のStock Solutionを以下の組成で調製します。

   Tris	121.1g	(60.5g)*
   EDTA・2Na・2H2O	3.72g	(1.86g)*
   蒸留水	1000mL	(500mL)*
   最後にHClにてpH8.0に調整する
   *(   )内は半量で調製する場合

2. 上で調製したStock Solutionを100倍希釈して洗浄用に使用します。

5.使用上の注意

1. イージーDNAピュア使用の際は、汚染防止のために必ずグローブを着用してください。
2. 未使用のイージーDNAピュアは、過度の湿気・光を避けて、乾冷所で保管してください。
3. 生物試料の取扱いについては、一般的な注意事項に従ってください。
4. イージーDNAピュアは人体に無害です。
5. 人の診断には用いないでください。
6. 試薬類が誤って目や口に入った場合、水で充分に洗い流す等の応急処置を行い、必要があれば医師の診察・手当て等を受けてください。

6.廃棄上の注意点

使用済みのカードを廃棄する場合は、オートクレーブ等で処理するか、1％次亜塩素酸等の消毒液に浸して処理することが望ましい。